MANF 减轻帕金森病大鼠模型的神经损伤
汪运红1，2，沈玉君2，冯利杰1，2，王海萍1，2，方圣云1，2，沈玉先
1，2
2012－02－20接收
基金项目：国家自然科学基金（编号：30772557、
30870881、81173074）作者单位：安徽医科大学1
基础医学院、2
生物药物研究所，合肥
230032
作者简介：汪运红，女，硕士研究生；
沈玉先，女，博士，教授，博士生导师，责任作者，E-mail ：sheyx@ustc．edu
摘要目的观察中脑星形胶质细胞源性神经营养因子
（MANF ）对6-OHDA 引起的多巴胺能神经元损伤的影响。
方法
表达纯化人重组MANF 蛋白；将6-OHDA 立体定位注射至大鼠纹状体区，
制备大鼠帕金森模型；将3个剂量（5、10、20μg ）纯化的MANF 注射至模型大鼠纹状体区，腹腔注射司来吉兰作为阳性对照，纹状体直接注射PBS 作为阴性对照；计数大鼠给药前后由阿扑诱导的由损伤侧向健侧不对称的旋转次数；免疫组化方法检测各大鼠黑质、纹状体部位酪氨酸羟化酶（TH ）阳性神经元和神经纤维。结果
10
μg MANF 组大鼠的旋转行为较PBS 组明显减少，效果与司来吉兰组相近。MANF 注射后对黑质部位TH 阳性神经元数量和纹状体部位TH 阳性神经纤维数量均有不同程度的明显恢复。结论MANF 能减轻6-OHDA 引起的帕金森模型
大鼠的神经损伤。
关键词
MANF ；帕金森病；动物模型；6-OHDA
中图分类号
R 742．5；R 965．1；R 965．2
文献标志码A 文章编号1000－1492（2012）07－0781－05
帕金森病（Parkinson disease ，PD ）是一种椎体外系进行性神经退化性疾病，
患者主要表现为静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓等。病理学主要表现为黑质多巴胺能神经元和纹状体多巴胺能神经纤维的数量显著下降
［1］
。中脑星形胶质细胞源性神经营
养因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor ，MANF ）是一种新型神经营养因子，体外实验已经证实其对多巴胺能神经元有保护作用
［2］
。体
内实验发现，在6-OHDA 注射前，单侧纹状体内注射MANF 能保护6-OHDA 引起的多巴胺能神经元的损伤
［3］
，但MANF 对6-
OHDA 引起的损伤有无作用，目前尚不清楚。现采用6-OHDA 诱导大鼠PD 模型，在出现行为改变后，给予不同剂量的人重组MANF ，同时选用目前市场上使用普遍的PD 药物司来吉兰（一代单胺氧化酶B 抑制剂）作为阳性
对照，观察MANF 对PD 大鼠模型的作用，为进一步探讨MANF PD 的应用前景提供依据。1材料与方法1．1
实验动物
SPF 级SD 大鼠，雄性，体重250
320g ，由安徽省实验动物中心提供。饲养室温20 25ħ，照明时间8ʒ00 20ʒ00，自由摄食与饮水。1．2
试剂与仪器
原核人重组MANF 质粒pET28a
（+）-MANF 以及BL21感受态细胞（均为本实验室构建及保存
［4］
）。Ni-NTA Agrose （Novagen 公司）；
层析柱（GE 公司）；6-OHDA 、阿扑（Sigma 公司）；大鼠脑立体定位仪（淮北正华生物仪器公司）；司来吉兰（Tocris 公司）；大鼠抗TH 单克隆抗体（Abcam 公司）；免疫组化试剂盒（中杉金桥公司）；其它试剂均为市售化学纯。1．3
MANF 蛋白的诱导表达与纯化
参考文献
［5］
中介绍的方法，将pET28a-MANF 质粒转化至BL21感受态细胞，
37ħ温箱摇菌过夜。以1ʒ100接种于培养基中扩大培养，
加入IPTG 诱导表达。收集菌体并裂解，离心取上清，转入已预装好的Ni-NTA Agrose 亲和层析柱中，进行蛋白纯化。将纯化后的蛋白装入预冷的超滤管中，加入PBS 缓冲液多次重复离心，浓缩目的蛋白。取少量蛋白稀释，分别做SDS-PAGE 和BCA 进行目的蛋白的鉴定和检测，计算蛋白浓度，分装保存于－80ħ冰箱内。1．4
PD 大鼠模型的制备
依据文献
［6］
中的方法，
取68只大鼠，
10%水合氯醛（3ml /kg ）腹腔注射麻醉。将大鼠头部固定于大鼠脑立体定位仪上，常规消毒后从正中纵形切开头皮，暴露颅骨表面，以前囟为基准点，参照大鼠脑立体定位图谱
［7］
，选用两点
法注射6-OHDA （2.5g /L ，含0.02%抗坏血酸无菌生理盐水）至大鼠纹状体，注射点坐标分别为（A /P +1.6，L /M +2.2，D /V －5）和（A /P －0.4，L /M +4，D /V －5），各点注射剂量均为10μg ，体积为4μl ，留8只作为空白对照组，不给予任何药物，留空针停至相同的时间，缝合并消毒伤口，待大鼠清醒后放回笼中继续饲养。1．5
动物分组及给药
造模3周后，将损伤后的大
鼠腹腔注射阿扑（0.5g /L ，含0.02%抗坏血酸的无菌生理盐水），并置于安静空旷地带，5 10min 后观察并计数大鼠向健侧不对称的旋转行为，观察30min ，平均每分钟旋转超过7次视为成功的PD 大鼠模型。将成功的PD 大鼠模型随机分组，每组8 9只，分别为：PBS 组，MANF 5μg 组，MANF 10μg 组，MANF 20μg 组，司来吉兰组。分别给于相应药物，PBS 和MANF （5、10、20μg ，一次性注射），体积均为7μl ，立体定位注射点为（A /P +1.0，L /M +2.7，D /V －5），司来吉兰（0.25mg /kg ·d ）腹腔注射给药，维持14d 。1．6
大鼠行为学检测
司来吉兰给药结束后，即损
伤后第6周，各实验组大鼠腹腔注射阿扑，观察计数其旋转行为，每隔2周进行1次行为学检测，给药后共进行3次行为学检测，其时间轴如图1所示，并记录每次各组大鼠的旋转次数
。
图1动物处理时间轴
6-OHDA 损伤后3周筛选成功模型，筛模1周后给药，给药后每隔2周进行1次行为学检测，
10周后处死所有大鼠。is ：纹状体内注射；ip ：腹腔内注射；SEL ：司来吉兰；Apo ：阿扑
1．7免疫组化分析大鼠损伤10周后处死，分别
取黑质、纹状体部位组织进行石蜡包埋，制备石蜡切片，
各部位均连续切取6张脑片，厚度为3μm 。石蜡切片常规脱蜡至水，置0.01mol /L 枸橼酸钠缓冲液中微波热修复10min ，
PBS 洗2min ˑ3次，0.5%Triton X-100室温透化25min ，3%H 2O 2室温10min 灭活内源性酶，去离子水洗2min ˑ3次。使用免疫组化SP 法试剂盒进行染（方法步骤按说明书）。染结果以细胞质中出现明显棕黄为阳性细胞，低倍镜下观察并拍摄照片，采用Image-pro plus 6.0图像分析软件，分别对黑质和纹状体部位阳性细胞数和阳性神经纤维平均光密度进行计算。结果以损伤侧阳性细胞数或平均光密度/健侧阳性细胞数或平均光密度百分数显示。
1．8
统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行统计
学处理，
计量资料以珋x ʃs 表示，组间数据采用单因素方差分析，其中行为学检测不同时间点各组的旋转次数分析采用双因素方差分析。2结果
buchi2．1
MANF 对PD 大鼠行为学的影响
60只造模
鼠中，43只为成功的PD 大鼠模型，随机分成5组，分别给药。计数给药前后各组大鼠的旋转圈数并进行比较，
结果见图2，给药后各组大鼠旋转圈数均有不同程度的减少，其中MANF 10μg 组以及SEL 组在给药后旋转圈数明显少于PBS 组（P ＜0.01），但MANF 10μg 组和SEL 组之间的差异无统计学意义。MANF 5μg 组以及20μg 组同PBS 组比较差异无统计学意义
。
图2
给药前后各组大鼠经阿扑诱导后的旋转行为的变化
A ：各组大鼠的旋转行为随时间的变化情况；
B ：所有检测时间点每组大鼠的累积旋转圈数比较；PBS ：PBS 组；SEL ：司来吉兰组；M5：MANF 5μg 组；M10：MANF 10μg 组；M20：MANF 20μg 组；与PBS 组比较：＊＊P ＜0.01
图3给药后大鼠黑质部位TH 阳性细胞存活情况
A ：大鼠黑质部位TH 染，SP ˑ10，A1 F1分别为正常对照（Con ）、PBS 组、MANF 5μg 组、MANF 10μg 组、MANF 20μg 组、司来吉兰组；A2 F2分别为各组的健侧黑质部位对照。
B ：大鼠黑质部位TH 阳性细胞计数。M5：MANF 5μg 组；M10：MANF 10μg 组；M20：MANF 20μg
组；SEL ：司来吉兰组；PBS ：PBS 组；Con 组：正常对照组；与PBS 组比较：*P ＜0.05，
＊＊
P ＜0.01；与M5组比较：#P ＜0.
05图4给药后各组大鼠纹状体部位TH 阳性神经纤维密度的观察
A ：大鼠纹状体部位TH 染，SP ˑ4，A1 F1分别为正常对照（Con ）、PBS 组、MANF 5μg 组、MANF 10μg 组、MANF 20μg 组、司来吉兰组；A2 F2分别为各组的健侧黑质部位对照。
B ：大鼠纹状体部位TH 阳性神经纤维平均光密度；M5：MANF 5μg 组；M10：MANF 10μg 组；
M20：MANF 20μg 组；SEL ：司来吉兰组；PBS ：PBS 组；Con 组：正常对照组；与PBS 组比较：*P ＜0.05，＊＊
P ＜0.01
2．2MANF 对PD 大鼠神经损伤的影响2．2．1
黑质部位TH 阳性细胞的存活数观察
PBS
组损伤侧黑质部位TH 阳性细胞数明显少于未损伤侧，见图3。给药后，各组TH 阳性细胞的存活数均有不同程度地恢复，其中MANF 10μg 组TH 阳性细胞数恢复最为明显（P ＜0.01），且同MANF 5μg 组比较其疗效差异具有统计学意义（P ＜0.05）。2．2．2
纹状体部位TH 阳性神经纤维平均光密度
观察6-OHDA 损伤后，毁损侧的纹状体TH 阳性神经纤维平均光密度明显小于其健侧，见图4。给药后，各组的TH 阳性神经纤维均有不同程度的
恢复，
其中MANF 10μg 组恢复最为明显（P ＜0.01），其余各组亦有所改善（P ＜0.05）。3
讨论
MANF 首先由Petrova et al ［2］在体外发现其具有特异性保护多巴胺能神经细胞的功能。而后发现
内质网（ER ）应激可上调其表达［8］
，并且能够在体外
保护由ER 应激引起的细胞死亡。本课题组在大鼠脑缺血模型上，观察到脑缺血可上调MANF 的表达，同时发现人重组MANF 能促进原代培养的神经元的增殖，并对ER 应激引起的神经元损伤有保护
作用［9］。本研究显示，在单侧纹状体内注射6-OH-DA诱导的大鼠PD模型中，大鼠行为学症状出现后，
采用同侧纹状体内相同位点注射MANF能够保护6-OHDA引起的多巴胺能神经元的损伤，这与Voutilainen et al［3］报道的在6-OHDA损伤前纹状体内注射MANF得到的实验结果一致，上述结果提示，MANF对6-OHDA引起的多巴胺能神经元的损伤有预防和作用。
目前临床上的各种药物手段均不能阻止PD进程，而只能延缓其发病时间［10］。临床上较为常用的药物———单胺氧化酶B抑制剂，因其抑制了单胺氧化酶的氧化作用，减少黑质部位自由基的形成，从而减轻了来自氧化应激对黑质部位多巴胺能神经元的损伤作用。本研究采用一代单胺氧化酶B抑制剂司来吉兰作为阳性对照，结果显示司来吉兰对6-OHDA引起的多巴胺能神经元的损伤同样有效，但作用比MANF稍弱。
本研究中，6-OHDA注入纹状体内后被纹状体内神经末梢摄取，转运至黑质神经元胞体后，选择性损伤多巴胺能神经元，进行性造成中脑多巴胺能神经元及轴突的变性，模拟了慢性神经退行性疾病的发展历程，是一种较理想的评价PD药物疗效的动物模型。TH是脑内重要的神经递质多巴胺合成的限速酶，其含量直接反映了该区域多巴胺能神经元或神经纤维的存活情况，也是评价PD药物疗效的一个重要指标。
MANF的作用是剂量依赖的，存在最适剂量，其原因目前还不清楚。MANF是一种分泌型蛋白，其功能的发挥可能有自分泌和旁分泌调节，但是否需要通过受体发挥作用未见报道。对MANF的结构研究［11］发现，MANF的C端有类似于Ku70蛋白中SAP结构域（该结构域对凋亡前体蛋白Bax具有抑制作
用），故推测该结构可能是MANF发挥其神经保护的基础。为避免全身给药存在血脑屏障而不能顺利到达损伤部位的问题，本研究采用立体定位直接注射MANF至纹状体内。然而，在临床应用前景方面，仍需要寻求针对MANF合适的给药方式。
参考文献
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－80．
MANF alleviates the neural lesion in rat model of Parkinson’s disease
Wang Yunhong1，2，Shen Yujun2，Feng Lijie1，2，et al
（1School of Basic Medical Sciences，2Institute
of Biopharmaceutical Research，Anhui Medical University，Hefei230032）
Abstract Objective To observe whether MANF（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor）
is effec-tive in restoration of6-OHDA lesioned dopaminergic neurons．Methods Human recombinant MANF was expressed and purified；The model of Parkinson’s disease was prepared by injecting6-OHDA into the striatums of the rats with a stereotaxic frame；The purified protein of MANF，with three doses of5，10and20μg，or PBS（as a nega-
tive control ）was injected into the same site of striatums of rats ；Selegiline was intraperitoneally injected as a posi-tive control ；The behavioral performance was tested by counting the times of apomorphine-induced rotational activity from lesion side to the intact side ；The numbers of tyrosine hydroxylase （TH ）positive neurons and fibers in sub-stantial nigra （SN ）and striatum （STR ）in each group of rats were observed by immunohistochemistry．Results 10μg of MANF was effective to reduced the behavioral performance of the PD rats compared with PBS group．Sele-giline showed the similar effect on PD rats．Meanwhile ，compared with PBS treatment ，the numbers of the TH posi-tive neurons in the parts of SN and the neuronal fibers in the parts of STR was significantly increased in the PD rats which treated with MANF and selegiline．Conclusion MANF restores the impairment of dopaminergic neurons in-
duced by 6-OHDA．Key words
MANF ；Parkinson ’s disease ；animal model ；6-OHDA
延迟预处理对兔缺血后肢肌的远期保护作用
褚
瑞，严中亚，方前进，王峦
摘要
目的
探讨预处理的延迟性保护机制对兔后肢
肌缺血区具有类似缺血预处理（IPC ）的远期保护作用。方法取健康兔24只，随机均分成3组：①IPC 组：右后肢接受5min 的缺血和5min 的再灌注，24h 后永久结扎股动脉。②预处理组：兔耳缘静脉注射3mg /kg ，
24h 后操作同IPC 组。③生理盐水组：用生理盐水3mg /kg 预处理，其余操作同IPC 组。所有兔3d 后，切取小腿腓肠肌光镜下免疫组化检测缺血区血管再生情况，并用Masson 染测定梗死面积。结果
预处理后缺血区可观测到CD31染阳
性细胞，且数量明显低于IPC 预处理组（P ＜0.05）。梗死面积亦明显小于生理盐水预处理组（P ＜0.05），大于IPC 预处理组。结论预处理具有和IPC 类似的促使缺血区微
血管的再生作用。
关键词
；预处理；延迟性保护；血管再生
中图分类号
R 971.2；R 619；R 658.3
文献标志码A 文章编号1000－1492（2012）07－0785－04
自从1986年Murry et al ［1］
发现了缺血预处理
（ischemic preconditioning ，IPC ）的现象以后，不断有
研究者在不同的动物试验中进行验证，
并证实此现象不仅存在于心脏，同时也存在于其他的组织器官。
由于IPC 的具体操作具有一定的侵入性，所以其在临床的使用范围受局限，有研究者又在IPC 机制的基础上发现了新的预处理方法，如：缺氧预处理、药
2012－03－19接收
作者单位：安徽医科大学附属省立医院心脏外科，合肥230001作者简介：褚
瑞，男，硕士研究生；
严中亚，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail ：yan20047@163．com
物预处理、快速起搏预处理、温度预处理［2］
、心脏牵张预处理、钙离子预处理等，从而为缺血组织，特别
是心脏缺血的保护开辟了新的领域。近年来有学者通过实验证实，预处理不仅具有类似IPC 的早期相保护效应［3］
，而且具有晚期延迟性保护作用［4］
。但是的这种保护作用目前研究仅限于减少组织缺血再灌注损伤，且主要研究对象是心肌，而能否像IPC 一样对永久性缺血组织具有长期的保护作用，报道甚少。现通过造成家兔后肢肌永久性梗死，测定梗死区域血管新生情况和梗死面积以探讨预处理的保护作用。1材料与方法
1．1
动物的分组及模型的制作动物模型的制作
参照以往文献［5－6］
，并稍作改进。健康成年新西兰
普通大白兔24只，体重2.5 3.0kg ，雌雄不限，由
安徽医科大学实验动物中心提供。随机分成3组，每组8只。①IPC 组：所有兔右后肢根部用止血带
加压捆扎造成短时间缺血5min ，
并释放5min ，重复4次，24h 后，3%钠（30mg /kg ）腹腔注射
麻醉，仰卧固定，右后肢股三角处剪毛，沿股动脉走行纵行切开右大腿根部皮肤，皮下组织，在腹股沟
韧带下方暴露出股动脉，套线结扎股动脉，造成下肢的永久性缺血后，缝合。3d 后，切取小腿腓肠肌免疫组化检测缺血区血管再生情况，并用Masson 染测定梗死面积。②预处理组：所有兔耳缘静脉注
射（3mg /kg ），
24h 后处理同IPC 组。③生理盐水组：所有兔耳缘静脉生理盐水注射，其余操作同