摘 要：本文主要针对高效液相谱法测定水产品中的孔雀石绿展开了探讨，通过结合具体的试验实例，对材料与方法作了详细的阐述，并对试验结果作了分析，以期能为有关方面的需要提供参考借鉴。
关键词：高效液相谱；测定；水产品；孔雀石绿
孔雀石绿为三苯甲烷类工业染料， 在水产养殖上可以有效的预防与各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小虫病，并能保持水产品的新鲜度。但是若人体摄入孔雀石绿，将会对健康产生极为严重的危害。因此，对水产品必要要有严格的测定，以防止孔雀石绿对人体健康带来不必要的影响。
一、材料与方法
中性氧化铝固相萃取柱（supelco公司，1g/3mL）；滤膜（上海安谱，0.45μm，有机相）。标准溶液：孔雀石绿标准品（0.1g，Sigma）；100μg/mL标准储备液：称取孔雀石绿标准品10mg（精确到0.1mg），用乙腈溶解并定容于100mL容量瓶中；1.0μg/mL标准中间液：吸取1.00mL标准储备液于100mL容量瓶中，用流动相定容；标准工作液：分别移取0.1、0.5、1.0、2.5、5.0mL标准中间液分装于100mL容量瓶中，用乙腈定容，制成1.0、5.0、10.0、25.0、50.0μg/L标准系列浓度。
仪器有高效液相谱仪（LC-20AB，岛津），配有荧光检测器；匀浆机（IKA，德国），漩涡混合器（IKA，德国）；离心机（Sigma3K30，德国）；超声波清洗器（KQ-2200DB，昆山市超声仪器公司）；固相萃取仪（MEDIWAX，美国）；多样品自动浓缩仪（V-700，BUCHI）；超纯水器（arium ® comfort I，sartorius）。
2.谱分析条件。谱柱：VarianPolarisC185μm4.6mm×250mm；流动相：乙腈：乙酸铵缓冲液（80：20，v/v）；流速1.0mL/min；柱温30℃；激发波长265nm、发射波长360nm；进样量20μL。
3.样品的前处理。（1）提取。称量5.00g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入
15mL乙腈，漩涡混合2min，10000r/min匀浆提取30s，6000r/min离心10min，取上清液至自动浓缩样品瓶中。另取一支50mL离心管，加入15mL乙腈，清洗匀浆机刀头，洗涤液转移至前一离心管。用玻璃棒捣碎离心管中的样品，漩涡混合2min，超声波提取10min，6000r/min离心10min，上清液合并至自动浓缩样品瓶中。（2）浓缩。将上清液放入多样品自动浓缩仪，50℃下浓缩至近干，用5mL乙腈溶解残渣。（3） 净化。中性氧化铝柱用5mL乙腈活化，样液过柱，用自动浓缩样品瓶收集流出液，5mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，合并流出液。（4）浓缩。将上清液放入多样品自动浓缩仪，50℃下浓缩至近干，乙腈定容至1mL，涡旋混匀，用0.45μm滤膜过滤，按照1.2的方法上机测定。
二、结果与分析
1.提取液的选择。标准中选择乙腈及乙酸盐缓冲液提取，同时加入盐酸羟胺和对甲苯磺酸，虽然提取效果很好，但是试验表明，仅用乙腈提取，回收率也较高。该法将提取液进行简化，减少了试剂的浪费，提高了提取效率。
2.提取方式的选择。应用《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定（GB/T19857-2005）》，发现高效液相谱法仅用匀浆机来提取。但试验中发现，水产品仅用匀浆机提取，
其回收率较差。反复试验发现，用漩涡混合、超声波及匀浆机提取的效果好，回收率较高。
3.谱条件的选择
（1）谱柱的选择。基于流动相的调整上，用C18作为分离谱柱，因其具有理想的峰形、分离度、目标峰保留时间，且应用广泛。
（2）流动相的选择。反复将乙腈和乙酸铵缓冲液的配比进行试验，发现乙腈体积分数为80%时，峰形较好，保留时间适中，且分离度理想，目标峰在11.2min出峰，杂峰都可以在15min以内流出（图1、2）。
4.标准曲线相关性、线性范围及检出限。孔雀石绿工作液浓度在1.0～50.0μg/L范围内的线性关系良好。以峰面积（Y）为纵轴，工作液浓度（X）为横轴，得到良好的线性关系，建立回归方程为Y=37190X+10109，r2=0.9997。按3倍信噪比计算，得出方法检出限为1.0μg/kg。
5.方法的准确度。选择鲫鱼、草鱼、河虾空白样品各1个，每个样品称取3份，分别准确加入1.0μg/mL标准中间液0.1mL，测定相关数据。上述水产品的平均加标回收率、相对标准
偏差分别为89.0%～96.5%、2.0%～2.2%（表1）。
三、结论
通过试验，建立了高效液相谱法测定水产品中孔雀石绿的分析方法。结果表明，选择乙腈为提取液，采用漩涡混合、超声波及匀浆机提取方式，C18柱作分离谱柱，乙腈体积分数为80%时，分离效果较好，孔雀石绿检出限为1.0μg/L，加标回收率及相对标准偏差分别为89.0%～96.5%、2.0%～2.2%。
四、结语
综上所述，人体摄入孔雀石绿，将会对健康产生极为严重的危害。因此，对其进行测定非常必要，而在高效液相谱法测定水产品中孔雀石绿的试验中，此方法能科学准确的得出孔雀石绿的含量，值得应用推广。
参考文献：
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[2]周蓉、赵国辉、沙雪、王世君.用高效液相谱仪测定水产品中孔雀石绿方法研究[J].科技致富向导.2012（07）.
[3]陈永平、张素青、李春青、林黎明.高效液相谱法测定水产品中孔雀石绿残留量方法的改进[J].动物医学进展.2011（11）.
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