紫芝发酵液中靛红的分离纯化与结构鉴定
摘要：紫芝发酵液经离心、乙酸乙酯萃取后进行硅胶柱层析，采用环己烷-乙酸乙酯和乙酸乙酯-乙醇系统梯度洗脱并结晶得化合物LZ-1。通过对LZ-1的紫外、质谱和核磁共振等波谱数据进行分析，结合文献对照确定该化合物的结构为吲哚-2，3-二酮，即靛红。
关键词：紫芝;靛红;吲哚; 发酵液
文献标识码：S567.31A
灵芝是担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），非褶菌目（Aphyllo- phorales）,灵芝科（Ganodermataceae）,灵芝属（Ganoderma）中的真菌[1]。自古以来被视为滋补强壮、固本扶正的珍贵中草药，是中医药宝库中的珍品。紫芝（Ganoderma sinensis）[2]作为灵芝属中的一种被《中国药典》收录。为探究灵芝的活性成分，人们先后从灵芝子实体、孢子、发酵液及菌丝体中分离纯化到多糖、三萜、核苷、甾醇和生物碱等多种化学成分。采用深层发酵法获得灵芝的活性成分具有很好的应用前景，而目前对灵芝发酵的研究大多集中在菌丝体中多糖及三萜化合物，其他方面的研究甚少。本实验对紫芝发酵液中的小分子化合物进行研究，以期发现灵芝中的其它活性成分，为以后的开发应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1仪器
低速离心机（J6-M1）为美国Beckman公司产品，旋转蒸发仪（RE-121）为瑞士Buchi公司产品，高效液相谱仪（510泵，PDA检测器）为美国Waters公司产品，核磁共振仪（Varian-Inova-400）为美国Varian公司产品，柱层析及薄层层析（TLC）用硅胶为烟台江友硅胶开发有限公司生产，试剂均为分析纯。
1.2菌种和培养基
供试菌种由上海医药工业研究院生物部实验室筛选并保存。
斜面培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L。
种子培养基：葡萄糖25 g/L，黄豆饼粉20 g/L， KH2PO4 3 g/L，MgSO4 ·7H2O1.5 g/L， pH自然。
发酵培养基：蔗糖35 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母膏2 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 ·7H2O0.5
g/L，维生素B1 0.05 g/L。
1.3液体培养
液体培养采用二级发酵法，接于斜面的菌种于28 ℃培养6 d后，接种于种子培养基，28 ℃，200 r/min培养4 d后，转接到发酵培养基中，28 ℃、180 r/min培养5 d。
1.4提取方法
发酵液经离心（4000 r/min, 3315×g,10 min）去除菌丝体，上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用无水硫酸钠去除水分，过滤，减压浓缩得暗红浆状物。
1.5分离纯化方法
浆状物用乙醇溶解，干法拌样，样品与硅胶比例为1∶1（V∶V），上硅胶柱，采用环己烷-乙酸乙酯，乙酸乙酯-乙醇系统梯度洗脱，环己烷-乙酸乙酯系统二者体积比依次为10∶1， 5∶1，2∶1，1∶1和1∶5；乙酸乙酯-乙醇系统二者体积比依次为4∶1， 3∶1， 1∶1，1∶5，最后纯乙醇。TLC跟踪检测，合并相同流分。环己烷-乙酸乙酯1∶1部分经乙酸乙酯重结晶得橙红针晶，
甲醇溶解后采用TLC和高效液相谱（HPLC）检测其纯度，紫外光谱（UV）、质谱（MS）和核磁共振（NMR）鉴定其结构。
2 结果与分析
橙红针晶化合物LZ-1溶于氯仿、甲醇、丙酮和乙酸乙酯。Rf=0.55 ［CHCl3-MeOH，9∶1（Vbuchi︰V）］。紫外吸收图谱显示该化合物紫外最大吸收值为UV(MeOH)λmax 242.3 nm，299.3 nm，说明分子中有取代的苯环结构。电喷雾质谱（ESI-MS）谱图中出现m/z170（M ++Na）峰及m/z146（M +-H）峰，确定该化合物的分子量为147。 1H NMR谱[400 MHz，氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）]中有5个质子信号，其中δ10.98（1H，s）为活泼氢质子信号，δ:7.57（1H，td, J=7.6 Hz,1.2 Hz）,7.48(1H,dd，J=7.6 Hz,1.2 Hz),7.05(1H,td,J=7.6 Hz,0.8 Hz) ,6.91(1H,dd,J=7.6 Hz,0.8 Hz)为邻位取代的苯环上的四个氢信号。13C NMR谱(100 MHz,DMSO-d6)出现8个碳信号，结合DEPT（Distortionless Enhancement by Polarization Transfer，即无畸变极化转移增益技术）谱图分析得出分子中有4个季碳信号，其中2个为羰基碳，另外有4个苯环上的叔碳信号[3]。根据碳氢原子个数及分子量推测化合物的分子式为C8H5NO2，与文献[4]对照，确定该化合物为吲哚-2.3-二酮（indole-2,3-dione），即靛红（isatin）。其结构式如图1所示，核磁数据见表1。
A：检测所用核磁共振仪为Varian XL-400，所用溶剂为DMSO-d6, B：检测所用核磁共振仪为Bruker DRX500，所用溶剂为DMSO-d6
A: Chemical shifts were measured in DMSO-d6 using a Varian XL-400 NMR spectrometer， B: Chemical shifts were measured in DMSO-d6 using a Bruker DRX500 NMR spectrometer
3 讨论
靛红是中药板蓝根及青黛中的重要有效成分，同时也是存在于动物及人体内的一种内源性的单胺氧化酶抑制剂，在神经系统中起着重要作用。文献报道靛红具有抗氧化、抗帕金森病、抗癫痫和降血脂等多种药理活性[5]，且毒性极低，具有开发为药物的前景。文献检索发现，靛红已从海洋微生物交替单胞菌（Alteromonas sp.）[6]、交替假单胞菌（Pseudoalteromonas spp）[3]和担子菌纲真菌裂褶菌（Schizophyllum commune）[7]的发酵液中分离纯化得到过，从紫芝发酵液中分离得到尚属首次，也是第一次发现紫芝发酵产生靛红。本实验进一步揭示了灵芝这一传统中药药理活性的物质根源。
桑红娇，等：紫芝发酵液中靛红的分离纯化与结构鉴定
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Isolation and Identification of Isatin from the Fermentation Broth of Ganoderma sinensis
SANG Hongjiao,ZHANG Qin,HU Haifeng,ZHU Baoquan
Biopharmaceutical Research Division, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai200040, China
Concentrated Ganoderma sinensis fermentation broths were extracted with ethyl acetate. Extracts were applied to a silica gel column and eluted with cyclohexane-ethyl acetate and with ethyl acetate-ethanol. The crystallized product, Compound LZ-1, was identified as indole-2, 3-dione (isatin) based on UV, MS and NMR spectral data.
Ganoderma sinensis；isatin；indole；fermentation broth