钟祥健，周娜，王欣，李金杰，刘嘉琛，王楷淇，
,，小＞
(北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京100191)
摘要：迷迭香的抗炎活性成分已有多篇文献报道归结于其中所含的鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸等，但将迷迭香乙醇提取物除去上述3种含量较多的成分后，剩余组分仍显示出较好的抗炎
活性，提示迷迭香中存在没被发现的抗炎活性成分#在体外抑制NLRP3炎症小体抗炎活性的筛
选结果指导下，利用各种谱技术和波谱学方法，从上述抗炎活性组分中，分离分析鉴定了3个黄酮类化合物：4，,5-二疑基-7-甲氧基黄酮(1)、5-疑基-7,4，-二甲氧基黄酮(2)和5-疑基-7,8,4'-三甲氧基黄酮(3)。对分离得到的3个化合物进行体外抑制NLRP3炎症小体的验证，均显示一定的抑制活性。其中化合物1的抑制活性最强，与阳性对照MCC950(炎症小体抑制剂)相当。化合物3是首次从迷迭香属植物中分离得到。
关键词：迷迭香；抗炎活性；分离纯化：结构分析鉴定
中图分类号:R284文章编号：1673-1689(2021)04-0082-09DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2021.04.010
Discovery of Bioactive Ingredients in Rosemary officinalis Inhibiting
NLRP3Inflammasome
ZHONG Xiangjian,ZHOU Na,WANG Xin,LI Jinjie,LIU Jiachen,
WANG Kaiqi,YUE Jianyu,JIA O Yue,SHANG Xiaoyca
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substance and Functional Foods,Beijing Union University,Beijing100191, China)
Abstract:The anti-inflammatory active ingredients of rosemary have been reported in many literatures,including carnosic acid,carnosol and ursolic acid.However,the rosemary ethanol extract still showed good anti-inflammatory activity after removal of the above three large-content components,suggesting that there were undiscovered anti-inflammatory ingredients in rosemary in addition to the reported active ingredients.Under the guidance of inhibiting the anti-inflammatory activity of NLRP3inflammasome in vitro,three flavonoids were isolated and identified from the above-mentioned anti-inflammatory components by various chromatographic techniques and spectroscopy methods including4',5-dihydroxy-7-methoxyflavone(1),5-dydroxy-7,4'-dimethoxy flavone(2)and5-hydrox
y-7,8,4'-trimethoxyflavone(3).The three isolated compounds were confirmed to possess inhibitory effect on NLRP3inflammasome in vitro.Among them,compound1
收稿日期：2020-01-14
基金项目：北京市教委科技计划重点项目(KZ201811417049)；北京联合大学领军人才项目(BPHR2018AZ01)；北京市教委面上项目(KM201911417014)；北京联合大学研究生科研创新资助项目(YZ2020K001)o
＞通信作者：尚小雅(1968—)，女，博士，研究员，主要从事生物活性物质发掘与作用机理研究。E-mail:*******************
■»JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.40Issue42021
钟祥健，等：迷迭香中抑制NLRP3炎症小体/性成分的发现
had the strongest inhibitory activity,comparable to the positive control MCC950(inflammatory inhibitor).Compound3was isolated from Rosmarinus for the first time.
Keywords:Rosemary officinalis,anti-inflammatory activity,isolation and purification,structural analysis and elucidation
迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)是唇形科迷迭香属草本植物#原产地为地中海沿岸，目前在我国广西、海南、云南和福建等省均有引种叫具有独特的香气#除了可用于烹饪外#也具有丰富的药用价值叫文献报道迷迭香提取物具有抗氧化、抗炎$抗肿瘤$神经保护$护肝保胃$抗菌$杀虫等作用叫是我国食品添加剂目录中的一种天然优良食用抗氧化剂，能改善食品品质，保，在药$护肤品等也有广泛的用叫
炎是病原体、异物或损伤的一种防御性反应叫控制炎中质的是抗炎的主要目标冋。NLRP3炎症小体是炎症反应的核，卜,
(ASC)和的天
氨酸水解酶-l(Caspase-l)等的物，可被尼日利亚菌(Nigericin)、ATP和病原体等种化，$病$海病$化等病叫有提，的抗炎食(类似地中海食)，可一炎症性病防或作用［8-9］o，食用资为，抗炎性物质的作用，抗炎性添加种食品中，能：食用的抗炎能食品，对于预防或病$ $海病和病等性病中炎的，具有的义&
目前，报道迷迭香提取物于炎有很明显的抑制作用㈣。作为抗炎膳食补充剂，可以改善结肠的炎性状［11］；在大鼠足肿胀实验中，可以明显降低体内炎症因子的表达［12］o显示，迷迭香抗炎性富的鼠尾草、鼠尾草酚和熊果等化物'13-叫在脂(LPS)诱导的炎症细胞模型中，能很好地抑制炎症因子的产㈣。但Arranz 等㈣现，鼠尾草、迷迭香的抗炎性比粗提物弱，提示：迷迭香中可能存在抗炎性更强的未知&作者所在课题组前期研究发现，将迷迭香中含量较大的上述已知抗炎剔除后，剩余
分仍显示较好的抗炎活性，与文献'16］报道一致；同时，液质析现活性的不是文献报道的抗炎性，进一步推测迷迭香中仍存在性较好、未被挖掘的抗炎性子&为明确迷迭香抗炎物质，在体外抗炎活性的筛选结果指下，未知抗炎性进行，为迷迭香作为抗炎功能食品或膳食补充剂的研发提供科学依据。
1.1材料试剂
迷迭香(Rosmarinus officinalis)原料由哈佛大学学院李豫伟教授鉴定，品存于北京联大学
物性物质能食品北京验& Sephadex LH-20凝胶：GE公司产品；木
(160~200目)和(TLC)GF254：青
海洋化产品；十八烷烷键(RPC18)：美国Teledyne Isco产品。石油、氯$$ $等剂：析纯，北化学剂厂产品；液所用$：美国Fisher公司产品；NLRP3和Caspase-1抗体：美国Adipogen公司产品；Caspase-1物：美国Promega产品；细胞剂：美国Gibco
产品；验用：美国Millipore产品。
1.2仪器设备
、中液：Buchi<；产；低(Flash)(/为ISCO产品)：Combiflash产；高效液相谱仪(Sunfire C18制备柱，19mm x250mm，5p,m；Sunfire C18分析柱，4.6mm x250mm，5|!m，Waters2998型检测器":Waters公司生产；Million-Q Integral纯水系统：国默克公司产品；Inova500
：美国Varian公司制造；PromegaGloMax 20/20测仪：美国Promega产；Q Exactive Plus液质联用分析仪：美国：产&
1.3实验方法
1.3.1抗炎活性筛选方法的建立及活性筛选
1)才、鼠原代骨髓巨噬细胞(BMDMs)的分离培
2021年第40卷第4期EM
ZHONG Xiangjian,et al；Discovery of Bioactive Ingredients in Rosemary
officinalis Inhibiting NLRP3Inflammasome
养饲养10~12周龄SPF级雌性C57BL/6雌鼠，取脱臼处死后小鼠的双侧股骨，用细注射器吸取DMEM培
养基反复冲出骨髓细胞转移至50mL离心管，离心去上清液后用体积分数10%胎牛血清（FBS）及1g/dL双抗的DMEM培养基重悬细胞，同时加入巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，终质量浓度为25ng/mL），培养5天后获得BMDMs。
2）刺激方式取分离培养好的BMDMs，用EDTA与胰酶联合消化后接种于96孔板中，用DMEM高糖培养基培养12h，之后将培养基：成质量浓度50ng/mL LPS的DMEM培养基，处
4h后,LPS刺激,80!g/mL质量浓度处1h，单体化合10^mol/L浓度处理1h （中不需要此步骤），再在实孔中加入Nigericin（NLRP3炎症小体激活剂），刺激45min。
3）的处理经过3500r/min离心后的细胞培养上清液，加入1/4体积三，-20!冰箱过夜。再经13000r/min、4!条件下离心20min，弃上清液加冰丙酮洗1,100!金属浴下，后加1x loading buffer40“L振荡混合，中，冷却后即为上清液％用PBS细胞3，于上，孔加入1x loading buffer200p,L,20min后刮下细胞，吸取细胞液，中15min，后为细胞 ％
4）Caspase-Glo®1Inflammasome Assay检测细胞中Caspase-1活性Q17R采用Caspase-1性检测细胞培养上清液Caspase-1的性，方，之后用PromegaGloMax20/20发光检测仪进行检测，由Excel数据处理％
5）分用SPSS数据
t，实验数"士s表示，与■组相比，以*$<0.05、**$<0.01、***$<0.001表示差的性。
1.3.2提取物的分离、纯化与分析
1）原料提取迷迭香原料10kg，体积分数100%12h，再分别采用体积分数100%、90%80%取，浓度取1, 1h，合并取液减压浓缩得到膏（1.56kg）。
膏饱和的乙酸乙酯溶解，得到酯相可溶部分和不溶部分。用体外抗性方法进行筛选，发现抗炎活性集中在乙酸乙酯可溶部分。酯可溶部分正相硅胶拌样，用正
常压硅胶柱谱分离，仿和甲体积比范围100：0~0：100为流动梯度洗脱，利用薄层谱（TLC）点板检测，合并相似洗脱流分，得到8个组分（M1—M8#。将分离得到的8分进行体外抗
性筛选，现M1—M6具有较好的抗性。
现，熊果齐墩果等类似主要集中
M2分中，鼠尾草酚和鼠尾草等主要集中在M3组分中，性最好的M5中几乎不含文献报道的上述抗分。
2）剩余活性组分的分离将M5用丙酮加热超声溶解，出大量沉淀，母液过Sephadex LH-20凝胶柱谱，
％（氯仿）:％（甲醇）=2：1为流动相洗脱,TLC点合并，得到6分（M5-1至M5-6）。其中M5-2出黄沉淀，将其多滤纯化后,TLC点板显为一个黄斑点，再经制备型高效液相谱分离纯化，流动相为体积分数75%甲溶液，出峰时间为21min，制备得到化合物1（20mg）。M5-3常压正相硅胶柱分离得到8个组分（M5-3-1至M5-3-8），富集M5-3-3中TLC显为黄的主斑点，分Sephadex LH-20凝胶柱谱纯化，流动为％（石油o）:%（氯仿）:％（甲）=
5：5：1。再经制备型HPLC进行纯化，流动相为体积分数80%甲醇水溶液，出峰时间分别为15min和19min，制备得到化合2（20mg）化合物3（35mg）。
3）化合的质谱分分离得到的体化合物用甲溶解，配制质量浓度为0.5mg/mL的溶液，过0.22!m滤膜后直接高分辨质谱分。高分辨质谱条件参数：电喷雾离子源正离子式，扫描模式为Full MS（必：100~500）/dd-MS2，鞘气流量50units，辅助气流量10units，离子源温度为380!，毛细管温度350!。分辨率为70000，碰量为55V。实流1。
2.1化合物的结构鉴定
化合物1为黄无定形粉末。1H-NMR谱的较高1个甲基峰质子！h3.83(3H,s)，区有7个芳环烯氢3h6.32(1H,d,)= 1.6Hz)和6.69(1H,d,*=1.6H z),!h6.80(1H,s), !h6.91(2H,d,*=8.7Hz)和7.91(2H,d,*=8.7Hz)；
■4JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.40Issue42021
钟祥健，等：迷迭香中抑制NLRP3炎症小体活性成分的发现
乙酸乙酯相迷迭香原料
!乙醇提取
浸膏
乙酸乙酯
超声溶解
滤渣
I正相硅胶柱
Ml M2M3
高效液相
检测
熊果酸
齐墩果酸
M5M6M7M8
M4
M5-1M5-2M5-3M5-4M5-5M5-6
沉淀过滤正相硅胶
高效液相凝胶
14000
13000
12000
11000
10000
3000
2000
1000
-1000
13.513.012.512.011.511.010.510.09.59.08.58.07.57.0 6.5 6.0 5.55.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0
(a)化合物1的氢谱图
蚩
舉
及
r
OOO
OOO
OOO
OOO
buchiOOO
OOO
9
8
7
6
5
4
鼠尾草酚鼠尾草酸
制备高效液相
，制备
化合物2
化合物3
高分辨一级质谱
确定分子式
高分辨二级质谱
推测结构
1400
1300
1901801701601501401301201101009080706050403020
(b)化合物1的碳谱图
图2化合物1的核磁图
Fig・2NMR spectra of compound1
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
000
00
2
1
9
8
7
6
5
4
3
2
1
-1
图1单体化合物分离、纯化与分析流程
Fig%1Separation,purification and analyses of monomeric compounds
&3C-NMR谱显示16个碳信号(图2)，推断结构是一个甲氧基取代的黄酮。HRESIMS—级质谱显示必: 285.07526[M+H]+(理论计算值：285.07575)，分子式为C16H13O5；二级碎片离子有270.05176、243.06042、242.05698、213.05431、167.03372、160.05173、145.02831、124.01554、119.04924、111.04424 (图3)；根据碎片离子推测此结构是4!,5-二羟基-7-甲氧基黄酮(图4)$将该化合物的核磁数据与文献[18]比对发现，二者数据一致，故确证了所推导结构的正确性。
化合物2为黄无定形粉末$1H-NMR谱数据显示在低场有7个芳环烯氢质子信号6.38(1H,
A,]=2.4Hz),6.79(1H,<,]=2.4Hz),7.11(2H,d,J= 8.9Hz),8.06(2H,d,]=8.9Hz),6.94(1H,s)；在较高场有2个甲氧基单峰质子信号衍3.85(3H,s)和3.87(3H,s)；13C-NMR谱显示17个碳信号，其有2个甲氧基碳信号&56.3和56.8，和1个炭基碳信号！c182.7(图5)，推断该物质为黄酮结构，有2甲氧基存在$HRESIMS—级质谱显示m/z：299.09100[M+H]+(理论计算值:299.09140"，分 子式为C17H15O5；二级碎片离子有284.06747、256.07257、227.06996、167.03372、146.85710、124.01555(图6)；根据碎片离子推测此结构是5-羟基-7,4!-二甲氧基黄酮(图7)$将化合物的核数据与文献[19]比较发现，二者数据一致，故确证了所推导结构的正确性$
化合物3为黄粉末$1H-NMR谱显示化合物存在3个甲氧基单峰质子信号，分为:!h3.73 (3H,s),3.86(3H,s)和3.93(3H,s)；6个烯氢质子信号6.94(1H,?),6.95(1H,s),7.11(2H,d，&二8.8Hz)和8.07(2H,d,&=8.8Hz)；在13C-NMR谱显示18个碳信号(图8)，推断是3个甲氧基取代的黄
2021年第40卷第4
期
ZHONG Xiangjian ,et al : Discovery of Bioactive Ingredients in Rosemary
officinalis Inhibiting NLRP3 Inflammasome
285.075 26 z=l
100959085807570656055504540353025201510
<、悭<；衩r
282.278 72 .1 z=?283.047 64 z=l
c 12h u o 8
.J -
284.294 53
z=?
285.278 41
z=?
c 18h 37o 2
286.078 64
z=l
c 23h 10
286.310 06
z=?
287.080 93 z=l C 23H n
288.252 66
z=?
%、鰹<；衩廷
2820
282.5
2810 283.5
284.0 2845
285.0
285.5
286.0
286.5
287.0
2875
288.0
m/z
⑻化合物啲一级质谱图
(b)化合物啲质谱图
图3化合物1的质谱图
Fig & 3 Mass spectra of compound 1
图4化合物1的结构式
Fig& 4 Structure of compound 1
酮。HRESIMS —级质谱显示 必：329.101 44[M+H]+
(理论计算值：329.101 96)，分子式为C i 8H i 7O 6；二级
碎片离子有 313.070 13、296.067 44、285.075 35、
269.075 84、268.072 51、253.049 27、240.077 74、
225.054 31、169.064 61、154.025 88、136.015 38、
133.064 70、132.056 90、108.020 82(图 9)；根据碎 片离子推测此结构是5-羟基-7,8,4!-三甲氧基黄
13.513.012.5 12.011.5 11.010.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5
3
(a)化合物2的氢谱图190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30
d
(b)化合物2的碳谱图
鰹舉茯r
图5化合物2的核磁图
Fig. 5 NMR spectra of compound 2
JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol. 40 Issue 4
2021
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