茶氨酸提取工艺
茶氨酸是茶树的特有成分之一,是茶叶的特征氨基酸,含量为干茶重量的1%～3%。近年来的研究发现,茶氨酸具有抑制引起的兴奋、舒缓神经、降血压和增强免疫力等多种保健及药用功能,开发应用前景广阔。目前通过酶法合成生产的茶氨酸,价格昂贵;用化学合成生产的茶氨酸的安全性还有待验证。从茶叶中直接提取茶氨酸由于它来源于天然产物,有着较好的安全性。调查发现,茶多酚生产企业的工业废液中含有约2%左右的茶氨酸,本方法研究了从茶多酚工业废液中提取纯化茶氨酸的工艺。
1.材料与方法
1.1原料与试剂
茶多酚工业废液由浙江东方茶业科技有限公司提供;壳聚糖(食品级,使用时用1%HAc配成1%的溶液)购自澳兴生物科技公司;大孔吸附树脂、阳离子交换树脂732购自安徽皖东化工厂;茶氨酸标样购自Sigma公司;2,4二硝基氟苯(DNFB)购自Merck公司;其余试剂均为分析纯。
1.2仪器设备
BuchiR-126旋转蒸发仪、ShimidzuUV-2550分光光度计、Orinon818酸度计、Waters液相谱仪、Eppendorf5810R高速离心机、YZ1515恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司)、BSZ-100分部收集器(上海沪西分析仪器厂)、玻璃谱柱(Υ20×200mm)
2．实验步骤
试验方法采用茶多酚工业废液作为原料,经絮凝、吸附、阳离子树脂交换和重结晶等工艺步骤来分离纯化茶氨酸。具体方法如下:
2.1絮凝实验在烧杯中加入一定浓度的茶多酚工业废液,用1mol/L稀盐酸调节pH值。在搅拌下缓慢加入絮凝剂,使其完全混合均匀,然后慢速搅拌养絮,直至絮凝反应结束。以溶液的吸光值(O.D650)的变化及茶氨酸的回收率作为絮凝效果评价指标。
2.2吸附实验取10mL吸附材料于三角瓶中,加入待处理液50mL,水浴摇床中平衡2h,过滤分离去除吸附剂,取清液。测定吸附前后溶液中茶氨酸及多酚等物质的含量,计算吸附材料的杂质吸附率及茶氨酸的保留率。
2.3离子交换实验
(1)静态交换实验:在烧杯分别加入已用不同pH值的柠檬酸缓冲液平衡过的树脂20g及原料液100mL,恒温水浴摇床中平衡2h,吸附平衡后过滤分离树脂与清液,测定交换前后溶液中茶氨酸的含量,计算树脂对茶氨酸的吸附容量。
吸附容量q=V(C0-C)/W(式中q为树脂重量交换容量(mg/g树脂),
V为溶液的体积(L),C0初始液中待测物的浓度(mg/L),C为平衡时待测物的浓度(mg/L),W为湿树脂的重量(g))。
(2)动态交换实验:转H+型的732树脂装柱(Υ20×200mm)后用缓冲液平衡,样液调pH后上柱吸附,观察不同浓度样液和不同流速下树脂渗漏、饱和的情况。流出液分段收集,HPLC法检测其茶氨酸含量。
2.4结晶
取粗茶氨酸(经阳离子交换工艺)少量配成80%(W/V)的水溶液,添加数倍体积无水乙醇,0℃下冷藏24h析晶。
2.5检测方法茶氨酸检测:
DNFB法HPLC分析检测。衍生方法:取50μL待测液加入50μL0.5mol/LNaHCO3、50μL1%DNFB,混匀后60℃避光保温1h,加入100μL0.01MKH2PO4终止反应。HPLC分析谱条件:Waters液相谱仪;KF-AA5μ(200×4.6mm)谱柱;柱温30℃;进样体积10μL;流速1.0mL/min;流动相A:pH6.4的60mmol/LNaAc-HAc缓冲液,流动相B:乙腈:水(1:1,v:v),B相在20min内从0至100%;检测器Waters2487,360nm。
3. 结果与分析
絮凝茶多酚工业废液中含有占干重2%左右的茶氨酸,同时还有可溶糖、蛋白质、多酚及素等杂质。这些杂质在废液中以悬浮及胶体态存在,影响茶氨酸的提取纯化,因此在对茶氨酸进行纯化时,必须对废液进行预处理,降低废液中蛋白质等杂质的含量,使溶液澄清。在工业中常用的澄清方法是絮凝与高速离心。离心法能耗大,设备价格昂贵,在实际生产中难以广泛应用。
本实验采用絮凝法来澄清废液,考虑到用离子交换柱来进一步纯化时所需的茶氨酸的上柱浓度,
buchi将废液配成10%(W/V)的溶液。采用明胶、聚丙烯酰胺等进行絮凝实验时,絮凝效果不佳,当采用壳聚糖作为絮凝剂时有较好的絮凝效果。